高低溫試驗箱三代測序技術(shù)PacBio和O

　　三代測序技術(shù)（PacBio和Oxford Nanopore）可解決基因組重復(fù)區(qū)域的組裝難題，提高基因組完整性，已成為發(fā)育、再生、腫瘤和其它疾病過程中細(xì)胞基因組組裝的主流技術(shù)。其中，納米孔（Nanopore）測序技術(shù)的迅速發(fā)展更使得測序成本顯著降低，并且由于其可實現(xiàn)超長讀長（高達(dá)1Mbp），在復(fù)雜基因組組裝中具有天然優(yōu)勢。然而，高低溫試驗箱目前Nanopore的測序錯誤分布廣泛（10-30%，圖1A），存在高錯誤局部區(qū)域（1000bp中存在50%測序錯誤，圖1B），并且高錯誤局部區(qū)域的發(fā)生隨著測序讀長增加而顯著增加（圖1C），從而導(dǎo)致超長文庫數(shù)據(jù)中20-30%的序列存在高錯誤區(qū)域�，F(xiàn)有的錯誤校正軟件只能通過裁剪的方式剔除高錯誤局部區(qū)域，顯著降低了Nanopore序列完整性和組裝完整性。

　　研究者提出了漸進(jìn)式序列校正策略，高低溫試驗箱首先選擇高精度的序列校正錯誤率的區(qū)域（圖2B），高低溫試驗箱之后優(yōu)選校正后高精度序列校正高錯誤局部區(qū)域，從而保證了序列校正速度和完整性（圖2C）；另外，研究者還提出漸進(jìn)式組裝策略，通過校正后高精度的序列組裝基因組骨架（圖2D），之后通過原始序列提升基因組完整度（圖2E），從而保證基因組組裝結(jié)果的正確性和完整性。研究者將上述模型開發(fā)了NECAT軟件，開放給國內(nèi)外其它科研人員，進(jìn)行長達(dá)1年的體驗提升。

　　隨后，研究者收集了多種模式生物Nanopore數(shù)據(jù)集進(jìn)行性能測試，結(jié)果表明：NECAT校正后序列平均精度可達(dá)95-98%，可恢復(fù)原始數(shù)據(jù)中99%的高錯誤局部區(qū)域（HERS），從而保留了序列長度完整性（表1）；NECAT組裝完整性明顯高于同類校正組裝軟件，且組裝錯誤量顯著低于同類軟件。另外，研究者將NECAT校正結(jié)果與多個組裝軟件結(jié)合使用發(fā)現(xiàn)：NECAT校正結(jié)果顯著提高其它Nanopore組裝軟件的組裝質(zhì)量。

　　后，研究者完成了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Nanopore測序，并應(yīng)用NECAT組裝出了完整度較高母細(xì)胞瘤癌癥基因組，通過組裝結(jié)果發(fā)現(xiàn)了很多高精度結(jié)構(gòu)變異（SV）位點，其很多位點都與目前實驗報道和功能預(yù)測相符（圖3）。與原始數(shù)據(jù)SV檢測方法相比，NECAT組裝結(jié)果檢測SV精度顯著高于目前SV檢測方法。高低溫試驗箱上述結(jié)果表明，通過NECAT序列校正，顯著降低高錯誤區(qū)域所造成的SV假陽性結(jié)果。

　　綜上所述，本研究提出的漸進(jìn)式校正組裝方法可以有效解決了Nanopore復(fù)雜測序錯誤問題，顯著提高了Nanopore數(shù)據(jù)組裝完整性、正確性和數(shù)據(jù)利用率。另外，通過NECAT序列校正，可以有效降低高錯誤區(qū)域SV的假陽性。(生物谷

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